与光 散射、渗透 压、超离心 ( 蔗糖密 度梯度离 心 )及 层析方 法 ( 凝胶过 滤 )相比, 用 S D s 聚丙 烯酸 胺凝 胶 电泳 分离 蛋 白质亚 基并测 定它 们的分子 量, 可 以避 免使 用昂贵的仪 器和 分离介质, 所以是一 个既 快又经 济又 比 较 精 确 的 方法.s D S 电泳过去 大部分 用管状 或垂 直板状 凝胶 来进 行使 用圆盘 电泳时, 标准与 未知 蛋 白不 能加 在 同一管凝 胶 中, 因而 难 以精确测 定分子 量. 使 用垂直平 板 电泳, 虽 然克服 了 以上缺点, 但一块胶通常 只 能分析 6一 10 个 样品, 且胶层 厚 (一 般为 Zm m ),分 辨率低. 干 燥时, 由于凝 胶收 缩而 导致分 子量测定 的误 差.
s D S 电泳如果在 水平 薄层凝 胶 中进行, 这 样不 仅一块胶可 以分 析几 十个 样品, 便于在相 同 条件下与 标准 比较 可得 到精 确的数 据, 而 且 胶 层 薄 (.0 ,m m ), 电泳时 间短, 分辨率高. 再则薄 层胶 电泳 后便于干 燥保 存 ( 只要 在甘 油溶液 中浸 饱一定时 间后, 在室 温下 自然干燥, 不 需要凝 胶干 燥器 ).水 平薄 层 S D S 电泳 的另一个优点 是便 于作为双 向 电泳的 第二 向.
S D S 电泳的原理S D S 电泳技术首 先 在 1 9 6 7 年 由 S ha Pir o建 立,2 9 6 9 年由 Webe r 和 osbo r n 进 一步 完善. 他们发 现, 在样 品介 质和聚丙 烯酞 胺凝 胶系统 中加人 十二 烷基 硫酸钠 (s od iu m dode e y l,ul afte,s D s) 后, 则蛋 白质分子的 电泳迁 移率主要取决 于它 的分子 量大 小, 其它 因素可 以忽略不 计. 、s D s 是 一种 阴离 子去 污剂, 它 能破坏 蛋 白质分 子之 间以及 与其 它物质分子 之间 的非共价键. 在强 还原 剂例 如硫基 乙醇或 二硫 苏搪醇 的存在 下, 蛋 白质分子 内的 二硫键被 打开 并解 聚成组成 它 们的 多肤链.解聚后 的蛋 白质分子 与S D S 充 分结合形成 带负电荷的蛋白质一S D S 复合物. 复合物 所带 的 S D S 负电荷大大 超过 了蛋 白质分子原 有的电荷量, 这就 消除 了不 同种类蛋 白质分 子之 间原有 的 电荷 差 异, 蛋 白 质-s D s 复合物在水溶 液 中的形 状像 一 个 长 椭 圆棒. 椭 圆棒的短轴对不 同的蛋 白质 亚 基一S D S复合物基本上 是相 同的, 约 为 18 入。 但 长轴 的长度 则与 蛋 白质分子量的大 小成正 比, 因此 这种 复合物 在 S D S一 聚丙 烯酞胺凝胶系 统中 的电泳 迁移 率不再 受蛋 白质原有电荷 的影 响, 而 主要取决于椭 圆棒的长 轴长度即蛋 白质及其亚基分 子量的大小. 当蛋 白质 的分子量在 1 50 0 到2 0 0 0 0 0 之间时, 电泳 迁移 率与 分子量的 对数呈线 性关系.fo g M W ~ 一 b·m 左 + K式中, M w 为 蛋 白质的 分子 量, m R 为相 对迁 移率,b 为 斜率, K 为 截距, 在 条件一定时,b 和 K均为常数.由此可 见,S D S 电泳不仅可 以分离蛋 白质, 而且 可 以根 据 迁移 率大小 测 定蛋 白质亚基 的分 子量。 这个规律对大部分蛋 白质是适用 的, 只 有少 数蛋 白质例外.均匀凝胶 的配方.衰 1 凝胶浓度与分子 t 测定的 关系凝胶浓度 交 联 度5%1 0%1 5%2.6%2。6%2.6%表 2 S D S 聚丙 烯酞 胺 均匀胶的 配方凝胶的 浓度 T 与交联度 C溶液 T ~ 5.1%,C ~ 2.6 %T ~ 7.5%,C = 2.6%2%6呱S D S 聚丙 烯酞胺凝胶的组 成与聚合水平薄 层 S D S 聚丙 烯酸 胺凝胶 电泳 可使用均 匀胶 也可 使 用梯度 胶. 前 者制胶 比较简便, 后 者制 胶 比较复 杂, 但 由于聚丙 烯酞 胺浓度梯 度在电泳 分离时起 到 了分子筛 的作用, 使 分辨 率大 大提 高.适合于复杂成 分 的样品 分析.凝 胶 的性 质对能 否得到 分子量与相对迁移率的 线性关系是 非常重要 的. 丙 烯酸胺 的不纯会 影 响凝 胶 的聚合 以及 谱带 的分离, 出现拖 尾现象.凝 胶的 聚合常 采 用化 学聚 合, 即用 适量的 过硫酸铱作 为催 化剂, 四 甲基 乙二 胺作为 加速 剂.为 了保 证 电泳时得 到 最佳分离 效果, 应尽 可能减 少过 硫酸按和 四 甲基 乙二胺 的量, 使聚 合大 约在 40 m in 到 h1 左右 完成 田.聚 合太慢 或聚合不充 分会 使 电泳 带畸变.聚合太快,过 量的 过硫酸胺 或四 甲基 乙二胺 会影 响样 品的分 离, 且 凝胶 在干 燥保 存时 会发 生龟 裂. 为 此,聚合时 温度 宜在 30 一 50 ℃.制 好的凝 胶要 在室温下 放置 1 h2 再 使 用, 以使凝 胶充分 聚合. 不能放在 冰箱中, 以防 S D S 在凝胶 中结晶.自制的 s D s 凝 胶在保 湿盒 中可 保存四天 左右.凝胶浓 度 的选择 取决 于被分 离的 蛋 白质 的分子 量. 如果 采 用均匀 胶, Weber 的实 验指出, 在 以下 浓度 时, 分 子量 的对数与 电泳迁移 率呈直线 关系, 见 表 1。
.表 2 为 S D S 聚 丙烯酸 胺均匀 凝胶 的配方.使用 均匀 浓度 的 S D s 聚丙 烯酸胺凝 胶来分析 测定 分子 量 范围很宽的 蛋 白 质 是 有 困 难的.特 别是 低 分 子 量 的 点 容 易偏 离 直 线.D u nke r 和 R u e e ke r t 指 出,1 0 多 的胶 可分析 的最 小分 子量为 l 万.5 外 的胶可 分析 最小 分 子量为 2 万。 为了 分析宽 范围的 分子量的 样品,并提高 分辨 率, 必 须使 用 S D S 聚丙 烯酸 胺梯度凝 胶.聚丙 烯酞胺凝 胶浓度梯度 的选择应根据样品成 分 的分子 量 范围. 如梯 度 8一 25 适 合 于分子 量范围为 1 0 0 0 0 到 3 0 0 0 0 0 的样 品. 梯度1 0一 15 适 合于 1 0 0 0 0 到 2 5 0 0 0 0 的样品.梯 度4一 1 5 适合 于 3 0 0 0 0 到 3 0 0 0 0 0 的样品.1 9 8 0 年 G 6r g 等`,,,,介绍 7 用水平薄 层 聚丙 烯酸胺 小孔梯度凝 胶作 S D s 电泳. 由于胶层薄 (。.s m m ), 冷却 效果 好, 能使用高 场强, 因此分辨率高, 分离时 间短, 且 由于胶 层薄, 染 色、 做 薄层 小孔 梯度凝胶 的配方. 梯度的线 性情况脱 色、保 存都比较容 易。 表 3 为 使 用 P h ar m ac ia 可 在凝 胶 中加 人一点 澳酚蓝后 用光密度计扫 描LK B 公 司 的梯度混合器 和梯度凝胶 模 具 来 制 来检查缓冲液与缓冲液凝胶 条与等 电聚 焦技术 相反, 缓冲 液是 S D S 电泳分离系统 中很 重要 的介质. 一 般来说,’在 蛋 白质稳 定的 p H 范围, 凡不 与 s D s 发生 相互作 用的 缓冲液 都可 以使 用, 但缓冲液 的选 择对 蛋 白带 的分离和 电 泳的速 度是 非常关键的.在 s D s 电泳系统 中需要使用样品 缓冲 液,凝胶 缓冲 液 以及电极 缓冲 液.样 品缓 冲液与 凝胶 缓冲液常 采 用同一 种系统. 系 统的 选择主 要考 虑对 蛋 白质样 品的 稳定性 和溶 解性 的 影 响.
样 品 缓冲液的离 子强 度一般低 于 凝 胶 缓 冲 液(如十 分之一 ), 但 s D S 的含量应 高于凝 胶缓 冲液. 电极 缓 冲液可 以采用 相同 的缓冲 系统也 可以 采用不 同 的缓冲 系统。
它 主要影 响 电 泳 速度. 如磷 酸缓 冲系 统 由于它 的高 导电性, 只 能使用低场 强, 所需的 电泳时 间是使 用咪 哇缓冲液 的一倍.电极 缓冲 液一般 只 能使用 四 五 次.
多 次使用会影 响 电泳 结果与 电泳 速度. 用后 的 电极 缓冲液 由于阳、 阴离子 各 自向负、正 电极 移动, 所以再行使 用时要混合阳、 阴极缓冲液, 然后再 分长 期 以来一 直使 用电极 缓冲液和 搭纸桥进行 S D S 电泳, 由于 需要经常 配置大 量 的缓冲液 给实验 带来很 多麻烦.近 几 年 P h ar m ac iaL K B 公司推 出了 一种新 技术, 用凝胶 条来 代替缓冲 液和 滤纸桥.缓冲 液凝胶 条是 用不 同 缓冲液配 制的聚 丙 烯酞胺 凝胶或 琼 脂 精 凝 胶 制 成的. 电泳时将凝 胶条放在 凝胶 表面上与 电极接触便可 以 了.使 用凝胶条不仅 不需要再配 置缓冲 液和 搭纸桥, 而 且可 以大 大 缩短 电 泳 时 间.使 用 电极 缓 冲液时,S D s 电泳 一 般 需 要 2一4小 时. 但使用凝胶 条只要 h1 左右, 浪酚 蓝便 可以到达前沿.